Bedtools是处理基因组信息分析的强大工具集合，本文列出自己学习其官方文档的几个点，对后面计算不同样品peak相似性的脚本做了下更新和调整，使用起来更为简单方便。

内容摘要

1. 区域注释，如peak注释，peak分布分析，peak与调控元件交集等。
2. 区域合并，如求算多样品peak合集，或合并重叠区域
3. 区域互补，如得到非基因区
4. 利用比对结果对测序广度和深度评估
5. 多样品peak相似性计算，评估ChIP类区域结果的样品相似性。

bedtools主要功能

bedtools: flexible tools for genome arithmetic and DNA sequence analysis.
usage:    bedtools <subcommand> [options]
The bedtools sub-commands include:
[ Genome arithmetic ]
    intersect     Find overlapping intervals in various ways.
                  求区域之间的交集，可以用来注释peak，计算reads比对到的基因组区域
                  不同样品的peak之间的peak重叠情况。
    window        Find overlapping intervals within a window around an interval.
    closest       Find the closest, potentially non-overlapping interval.
                  寻找最近但可能不重叠的区域
    coverage      Compute the coverage over defined intervals.
                  计算区域覆盖度
    map           Apply a function to a column for each overlapping interval.
    genomecov     Compute the coverage over an entire genome.
    merge         Combine overlapping/nearby intervals into a single interval.
                  合并重叠或相接的区域
    cluster       Cluster (but don't merge) overlapping/nearby intervals.
    complement    Extract intervals _not_ represented by an interval file.
                  获得互补区域
    subtract      Remove intervals based on overlaps b/w two files.
                  计算区域差集
    slop          Adjust the size of intervals.
                  调整区域大小，如获得转录起始位点上下游3 K的区域
    flank         Create new intervals from the flanks of existing intervals.
    sort          Order the intervals in a file.
                  排序，部分命令需要排序过的bed文件
    random        Generate random intervals in a genome.
                  获得随机区域，作为背景集
    shuffle       Randomly redistrubute intervals in a genome.
                  根据给定的bed文件获得随机区域，作为背景集
    sample        Sample random records from file using reservoir sampling.
    spacing       Report the gap lengths between intervals in a file.
    annotate      Annotate coverage of features from multiple files.
[ Multi-way file comparisons ]
    multiinter    Identifies common intervals among multiple interval files.
    unionbedg     Combines coverage intervals from multiple BEDGRAPH files.
[ Paired-end manipulation ]
    pairtobed     Find pairs that overlap intervals in various ways.
    pairtopair    Find pairs that overlap other pairs in various ways.
[ Format conversion ]
    bamtobed      Convert BAM alignments to BED (& other) formats.
    bedtobam      Convert intervals to BAM records.
    bamtofastq    Convert BAM records to FASTQ records.
    bedpetobam    Convert BEDPE intervals to BAM records.
    bed12tobed6   Breaks BED12 intervals into discrete BED6 intervals.
[ Fasta manipulation ]
    getfasta      Use intervals to extract sequences from a FASTA file.
                  提取给定位置的FASTA序列
    maskfasta     Use intervals to mask sequences from a FASTA file.
    nuc           Profile the nucleotide content of intervals in a FASTA file.
[ BAM focused tools ]
    multicov      Counts coverage from multiple BAMs at specific intervals.
    tag           Tag BAM alignments based on overlaps with interval files.
[ Statistical relationships ]
    jaccard       Calculate the Jaccard statistic b/w two sets of intervals.
                  计算数据集相似性
    reldist       Calculate the distribution of relative distances b/w two files.
    fisher        Calculate Fisher statistic b/w two feature files.
[ Miscellaneous tools ]
    overlap       Computes the amount of overlap from two intervals.
    igv           Create an IGV snapshot batch script.
                  用于生成一个脚本，批量捕获IGV截图
    links         Create a HTML page of links to UCSC locations.
    makewindows   Make interval "windows" across a genome.
                  把给定区域划分成指定大小和间隔的小区间 (bin)
    groupby       Group by common cols. & summarize oth. cols. (~ SQL "groupBy")
                  分组结算，不只可以用于bed文件。
    expand        Replicate lines based on lists of values in columns.
    split         Split a file into multiple files with equal records or base pairs.

安装bedtools

（Linux - Conda软件安装方法）

ct@ehbio:~$ conda install bedtools

获得测试数据集(http://quinlanlab.org/tutorials/bedtools/bedtools.html)

ct@ehbio:~$ mkdir bedtools
ct@ehbio:~$ cd bedtools
ct@ehbio:~$ url=https://s3.amazonaws.com/bedtools-tutorials/web
ct@ehbio:~/bedtools$ curl -O ${url}/maurano.dnaseI.tgz
ct@ehbio:~/bedtools$ curl -O ${url}/cpg.bed
ct@ehbio:~/bedtools$ curl -O ${url}/exons.bed
ct@ehbio:~/bedtools$ curl -O ${url}/gwas.bed
ct@ehbio:~/bedtools$ curl -O ${url}/genome.txt
ct@ehbio:~/bedtools$ curl -O ${url}/hesc.chromHmm.bed

交集 (intersect)

查看输入文件，bed格式，至少三列，分别是染色体，起始位置(0-based,

包括)，终止位置

(1-based，不包括)。第四列一般为区域名字，第五列一般为空，第六列为链的信息。更详细解释见
http://www.genome.ucsc.edu/FAQ/FAQformat.html#format1。

自己做研究CpG岛信息可以从UCSC的Table Browser获得，具体操作见
http://blog.genesino.com/2013/05/ucsc-usages/。

ct@ehbio:~/bedtools$ head -n 3 cpg.bed exons.bed
==> cpg.bed <==
chr1    28735   29810   CpG:_116
chr1    135124  135563  CpG:_30
chr1    327790  328229  CpG:_29
==> exons.bed <==
chr1    11873   12227   NR_046018_exon_0_0_chr1_11874_f 0   +
chr1    12612   12721   NR_046018_exon_1_0_chr1_12613_f 0   +
chr1    13220   14409   NR_046018_exon_2_0_chr1_13221_f 0   +

获得重叠区域(既是外显子，又是CpG岛的区域)

ct@ehbio:~/bedtools$ bedtools intersect -a cpg.bed -b exons.bed | head -5
chr1    29320   29370   CpG:_116
chr1    135124  135563  CpG:_30
chr1    327790  328229  CpG:_29
chr1    327790  328229  CpG:_29
chr1    327790  328229  CpG:_29

输出重叠区域对应的原始区域(与外显子存在交集的CpG岛)

ct@ehbio:~/bedtools$ bedtools intersect -a cpg.bed -b exons.bed -wa -wb > | head -5

• chr1 28735 29810 CpG:_116 chr1 29320 29370
• NR_024540_exon_10_0_chr1_29321_r 0 -
• chr1 135124 135563 CpG:_30 chr1 134772 139696
• NR_039983_exon_0_0_chr1_134773_r 0 -
• chr1 327790 328229 CpG:_29 chr1 324438 328581
• NR_028322_exon_2_0_chr1_324439_f 0 +
• chr1 327790 328229 CpG:_29 chr1 324438 328581
• NR_028325_exon_2_0_chr1_324439_f 0 +
• chr1 327790 328229 CpG:_29 chr1 327035 328581
• NR_028327_exon_3_0_chr1_327036_f 0 +

计算重叠碱基数

ct@ehbio:~/bedtools$ bedtools intersect -a cpg.bed -b exons.bed -wo | head -10

• chr1 28735 29810 CpG:_116 chr1 29320 29370
• NR_024540_exon_10_0_chr1_29321_r 0 - 50
• chr1 135124 135563 CpG:_30 chr1 134772 139696
• NR_039983_exon_0_0_chr1_134773_r 0 - 439
• chr1 327790 328229 CpG:_29 chr1 324438 328581
• NR_028322_exon_2_0_chr1_324439_f 0 + 439
• chr1 327790 328229 CpG:_29 chr1 324438 328581
• NR_028325_exon_2_0_chr1_324439_f 0 + 439
• chr1 327790 328229 CpG:_29 chr1 327035 328581
• NR_028327_exon_3_0_chr1_327036_f 0 + 439
• chr1 713984 714547 CpG:_60 chr1 713663 714068
• NR_033908_exon_6_0_chr1_713664_r 0 - 84
• chr1 762416 763445 CpG:_115 chr1 761585 762902
• NR_024321_exon_0_0_chr1_761586_r 0 - 486
• chr1 762416 763445 CpG:_115 chr1 762970 763155
• NR_015368_exon_0_0_chr1_762971_f 0 + 185
• chr1 762416 763445 CpG:_115 chr1 762970 763155
• NR_047519_exon_0_0_chr1_762971_f 0 + 185
• chr1 762416 763445 CpG:_115 chr1 762970 763155
• NR_047520_exon_0_0_chr1_762971_f 0 + 185

计算第一个(-a)bed区域有多少个重叠的第二个(-b)bed文件中有多少个区域

ct@ehbio:~/bedtools$ bedtools intersect -a cpg.bed -b exons.bed -c | head
chr1    28735   29810   CpG:_116    1
chr1    135124  135563  CpG:_30 1
chr1    327790  328229  CpG:_29 3
chr1    437151  438164  CpG:_84 0
chr1    533219  534114  CpG:_94 0
chr1    544738  546649  CpG:_171    0
chr1    713984  714547  CpG:_60 1
chr1    762416  763445  CpG:_115    10
chr1    788863  789211  CpG:_28 9

另外还有-v取出不重叠的区域,

-f限定重叠最小比例，-sorted可以对按sort -k1,1 -k2,2n排序好的文件加速操作。

同时对多个区域求交集 (可以用于peak的多维注释)

# -names标注注释来源
# -sorted: 如果使用了这个参数，提供的一定是排序好的bed文件
ct@ehbio:~/bedtools$ bedtools intersect -a exons.bed \
    -b cpg.bed gwas.bed hesc.chromHmm.bed -sorted -wa -wb -names cpg gwas chromhmm \
    | head -10000  | tail -10

• chr1 27632676 27635124
• NM_001276252_exon_15_0_chr1_27632677_chromhmm chr1 27633213
• 27635013 5_Strong_Enhancer
• chr1 27632676 27635124
• NM_001276252_exon_15_0_chr1_27632677_chromhmm chr1 27635013
• 27635413 7_Weak_Enhancer
• chr1 27632676 27635124 NM_015023_exon_15_0_chr1_27632677_f
• chromhmm chr1 27632613 27632813 6_Weak_Enhancer
• chr1 27632676 27635124 NM_015023_exon_15_0_chr1_27632677_f
• chromhmm chr1 27632813 27633213 7_Weak_Enhancer
• chr1 27632676 27635124 NM_015023_exon_15_0_chr1_27632677_f
• chromhmm chr1 27633213 27635013 5_Strong_Enhancer
• chr1 27632676 27635124 NM_015023_exon_15_0_chr1_27632677_f
• chromhmm chr1 27635013 27635413 7_Weak_Enhancer
• chr1 27648635 27648882 NM_032125_exon_0_0_chr1_27648636_f cpg
• chr1 27648453 27649006 CpG:_63
• chr1 27648635 27648882 NM_032125_exon_0_0_chr1_27648636_f
• chromhmm chr1 27648613 27649413 1_Active_Promoter
• chr1 27648635 27648882 NR_037576_exon_0_0_chr1_27648636_f cpg
• chr1 27648453 27649006 CpG:_63
• chr1 27648635 27648882 NR_037576_exon_0_0_chr1_27648636_f
• chromhmm chr1 27648613 27649413 1_Active_Promoter

合并区域

bedtools merge输入的是按sort -k1,1 -k2,2n排序好的bed文件。

只需要输入一个排序好的bed文件，默认合并重叠或邻接区域。

ct@ehbio:~/bedtools$ bedtools merge -i exons.bed | head -n 5
chr1    11873   12227
chr1    12612   12721
chr1    13220   14829
chr1    14969   15038
chr1    15795   15947

合并区域并输出此合并后区域是由几个区域合并来的

ct@ehbio:~/bedtools$ bedtools merge -i exons.bed -c 1 -o count | head -n 5
chr1    11873   12227   1
chr1    12612   12721   1
chr1    13220   14829   2
chr1    14969   15038   1
chr1    15795   15947   1

合并相距90 nt内的区域，并输出是由哪些区域合并来的

# -c: 指定对哪些列进行操作
# -o: 与-c对应，表示对指定列进行哪些操作
# 这里的用法是对第一列做计数操作，输出这个区域是由几个区域合并来的
# 对第4列做收集操作，记录合并的区域的名字，并逗号分隔显示出来
ct@ehbio:~/bedtools$ bedtools merge -i exons.bed -d 340 -c 1,4 -o count,collapse | head -4
chr1    11873   12227   1   NR_046018_exon_0_0_chr1_11874_f
chr1    12612   12721   1   NR_046018_exon_1_0_chr1_12613_f
chr1    13220   15038   3   NR_046018_exon_2_0_chr1_13221_f,NR_024540_exon_0_0_chr1_14362_r,NR_024540_exon_1_0_chr1_14970_r
chr1    15795   15947   1   NR_024540_exon_2_0_chr1_15796_r

计算互补区域

给定一个全集，再给定一个子集，求另一个子集。比如给定每条染色体长度和外显子区域，求非外显子区域。给定基因区，求非基因区。给定重复序列，求非重复序列等。

重复序列区域的获取也可以用下面提供的链接：
http://blog.genesino.com/2013/05/ucsc-usages/。

ct@ehbio:~/bedtools$ head genome.txt
chr1    249250621
chr10   135534747
chr11   135006516
chr11_gl000202_random   40103
chr12   133851895
chr13   115169878
chr14   107349540
chr15   102531392
ct@ehbio:~/bedtools$ bedtools complement -i exons.bed -g genome.txt | head -n 5
chr1    0   11873
chr1    12227   12612
chr1    12721   13220
chr1    14829   14969
chr1    15038   15795

基因组覆盖广度和深度

计算基因组某个区域是否被覆盖，覆盖深度多少。有下图多种输出格式，也支持RNA-seq数据，计算junction-reads覆盖。

genome.txt里面的内容就是染色体及对应的长度。

# 对单行FASTA，可如此计算
# 如果是多行FASTA，则需要累加
ct@ehbio:~/bedtools$ awk 'BEGIN{OFS=FS="\t"}{\
    if($0~/>/) {seq_name=$0;sub(">","",seq_name);} \
    else {print seq_name,length;} }' ../bio/genome.fa | tee ../bio/genome.txt
chr1    60001
chr2    54001
chr3    54001
chr4    60001
ct@ehbio:~/bedtools$ bedtools genomecov -ibam ../bio/map.sortP.bam -bga \
    -g ../bio/genome.txt | head
# 这个warning很有意思，因为BAM中已经有这个信息了，就不需要提供了
*****
*****WARNING: Genome (-g) files are ignored when BAM input is provided.
*****
# bedgraph文件，前3列与bed相同，最后一列表示前3列指定的区域的覆盖度。
chr1    0   11  0
chr1    11  17  1
chr1    17  20  2
chr1    20  31  3
chr1    31  36  4
chr1    36  43  6
chr1    43  44  7
chr1    44  46  8
chr1    46  48  9
chr1    48  54  10

两个思考题：

怎么计算有多少基因组区域被测到了？

怎么计算平均测序深度是多少？

数据集相似性

bedtools jaccard计算的是给定的两个bed文件之间交集区域(intersection)占总区域(union-intersection)的比例(jaccard)和交集的数目(n_intersections)。

ct@ehbio:~/bedtools$ bedtools jaccard \
    -a fHeart-DS16621.hotspot.twopass.fdr0.05.merge.bed \
    -b fHeart-DS15839.hotspot.twopass.fdr0.05.merge.bed
intersection    union-intersection  jaccard n_intersections
81269248    160493950   0.50637 130852

小思考：1. 如何用bedtools其它工具算出这个结果？2. 如果需要比较的文件很多，怎么充分利用计算资源？

一个办法是使用for循环,

双层嵌套。这种用法也很常见，不管是单层还是双层for循环，都有利于简化重复运算。

ct@ehbio:~/bedtools$ for i in *.merge.bed; do \
    for j in *.merge.bed; do \
    bedtools jaccard -a $i -b $j | cut -f3 | tail -n +2 | sed "s/^/$i\t$j\t/"; \
    done; done >total.similarity

另一个办法是用parallel，不只可以批量，更可以并行。

root@ehbio:~# yum install parallel.noarch
# parallel 后面双引号("")内的内容为希望用parallel执行的命令，
# 整体写法与Linux下命令写法一致。
# 双引号后面的 三个相邻冒号 (:::)默认用来传递参数的，可多个连写。
# 每个三冒号后面的参数会被循环调用，而在命令中的引用则是根据其出现的位置，分别用{1}, {2}
# 表示第一个三冒号后的参数，第二个三冒号后的参数。
#
# 这个命令可以替换原文档里面的整合和替换, 相比于原文命令生成多个文件，这里对每个输出结果
# 先进行了比对信息的增加，最后结果可以输入一个文件中。
#
ct@ehbio:~/bedtools$ parallel "bedtools jaccard -a {1} -b {2} | awk 'NR> | cut -f 3 \
    | sed 's/^/{1}\t{2}\t/'" ::: `ls *.merge.bed` ::: `ls *.merge.bed`  >totalSimilarity.2
# 上面的命令也有个小隐患，并行计算时的输出冲突问题，可以修改为输出到单个文件,再cat到一起
ct@ehbio:~/bedtools$ parallel "bedtools jaccard -a {1} -b {2} | awk 'NR> | cut -f 3 \
    | sed 's/^/{1}\t{2}\t/' >{1}.{2}.totalSimilarity_tmp" ::: `ls *.merge.bed` ::: `ls *.merge.bed`
ct@ehbio:~/bedtools$ cat *.totalSimilarity_tmp >totalSimilarity.2
# 替换掉无关信息
ct@ehbio:~/bedtools$ sed -i -e 's/.hotspot.twopass.fdr0.05.merge.bed//' \
    -e 's/.hg19//' totalSimilarity.2  

totalSimilarity.2数据表格式如下 (数据是假的)：

fMusle_leg-DS19115    fMusle_back-DS18454    0.55
fMusle_leg-DS19115    fHeart-DS15643    0.4
fHeart-DS15643    fHeart-DS16621    0.8
fHeart-DS15643    fHeart-DS15839    0.7
fHeart-DS16621    fHeart-DS15839    0.7

得到结果后，就可以绘制相关性热图或PCA了。

也可以使用下面的命令转换成Wide format矩阵，用高颜值可定制在线绘图工具-第三版绘制。

# 这里面b和c可以用一个，因为是一个对称阵
# 如果2和3列内容不同，此脚本也可用
ct@ehbio:~/bedtools$ awk 'BEGIN{OFS=FS="\t"}{a[$1, $2]=$3; b[$1]=1; c[$2]=1;}END\
    {printf("ID"); for(i in c) printf("\t%s",  i); \
        for (i in b) {printf("%s", i); for(j in c) {printf("\t%s", a[i, j]);} print "";}}

原文档(
http://quinlanlab.org/tutorials/bedtools/bedtools.html)的命令，稍微有些复杂，利于学习不同命令的组合。使用时推荐使用上面的命令。

ct@ehbio:~/bedtools$ parallel "bedtools jaccard -a {1} -b {2} \
      | awk 'NR>1' | cut -f 3 \
      > {1}.{2}.jaccard" \
     ::: `ls *.merge.bed` ::: `ls *.merge.bed`

This command will create a single file containing the pairwise Jaccard

measurements from all 400 tests.

find . \
    | grep jaccard \
    | xargs grep "" \
    | sed -e s"/\.\///" \
    | perl -pi -e "s/.bed./.bed\t/" \
    | perl -pi -e "s/.jaccard:/\t/" \
    > pairwise.dnase.txt

A bit of cleanup to use more intelligible names for each of the samples.

cat pairwise.dnase.txt \
| sed -e 's/.hotspot.twopass.fdr0.05.merge.bed//g' \
| sed -e 's/.hg19//g' \
> pairwise.dnase.shortnames.txt

Now let’s make a 20x20 matrix of the Jaccard statistic. This will allow

the data to play nicely with R.

awk 'NF==3' pairwise.dnase.shortnames.txt \
| awk '$1 ~ /^f/ && $2 ~ /^f/' \
| python make-matrix.py \
> dnase.shortnames.distance.matrix